生命科学光学
荧光蛋白光学成像注意事项
荧光蛋白扩展了科学荧光工具箱，从而实现了新的功能。同时，它们也带来了新的需要考虑的因素。当决定在应用中使用荧光蛋白时，应考虑哪些因素?
重要的是要记住，大多数荧光蛋白的应用都涉及到显微镜，感兴趣的波长从紫外延伸到红外。因此，影响显微成像的附件很重要。 对于大多数应用，重点是可见。然而，人们对远红色的兴趣越来越大，这主要是因为这些光子能量较低，因此造成的细胞损伤较小。
特定的应用有不同的需求。例如，在活细胞成像中，一个常见的应用是观察细胞运动。捕捉事件需要图像采集，这反过来又需要短的曝光时间。因此，光学系统应包括高灵敏度检测器和适当明亮的光源，以及具有正确数值孔径和其他特性的物镜。
应该使用的好的滤光片组，他们是为了高吞吐量而优化的。关键参数包括：非常陡峭的光谱边缘和高的带外阻挡，从而允许尽可能多的所需光通过，同时阻挡不需要的杂散光。此外，滤光片通常需要高透过率（T%），这带来了重要的好处。荧光蛋白必须被激发成荧光，这意味着活细胞必须暴露于激发光。然而，强烈的激发光可以通过光毒性损伤细胞，并增加光漂白的速率。前者破坏细胞，而后者破坏荧光蛋白信号。高透过率的滤光片允许更多的激发光进入，并允许更好的发射收集效率。因此，它们可以减少光毒性和光漂白，从而增强活细胞成像。
活细胞是这些应用的焦点，光学元件对这一应用也有影响。通常，细胞样品必须保持在 37°C，通常在受控的 CO2 浓度和湿度下。这些环境条件可以使用镜头下外置的细胞培养箱来实现，并且任何滤光片都可以位于该箱体内。在这种情况下，选择可能是硬镀膜滤光片。它们不会因这些环境条件而退化或受损。 另一方面，软镀膜滤光片可能会被损坏。通常，在任何情况下，滤光片和其他光学部件的牢靠性都很重要。
对于光活化或光漂白应用，还有其他考虑因素。它们通常需要两个不同的激发带，一个用于光转换，另一个用于激发。两者都至少在同一光路上传播，输出发射也是如此。因此，必须使用二向色镜分束片和相关滤光片。 光学器件必须具有宽的反射带，包括紫外线反射。需要后者，因为光转换通常需要 UV 光源。
挑战在于：高能紫外线照射会造成细胞损伤，因此必须小心优化照射强度。一种方法是通过中性密度滤光片。另一个是减少曝光时间。由于光路重叠，激发路径中的滤光片需要在任何发射波长的通带内具有良好的阻挡。
使用光学荧光灯源实现高分辨率显微镜对光学组件提出了自己的要求。大于衍射极限需要有效的多次通过。因此，与活细胞成像一样，该应用得益于高透过率滤光片和由此产生的吞吐量增加。
在多色成像的情况下，需要分离荧光蛋白信号。哈佛大学研究人员 Jean Livet 和 Jeff Lichtman 于 2007 年的 Brainbow 小鼠就是一个科学上重要的例子。现在，这些转基因小鼠在其神经元中随机排列了荧光蛋白。由于整合位点有多个转基因拷贝，每个神经元可能表达多种可能的荧光蛋白组合和不同的色调之一。可能有 150+ 种可区分的颜色，通过使用启动子修饰表达和产生的颜色。
（照片经马萨诸塞州剑桥哈佛大学分子和细胞生物学教授 Jeffrey Lichtman 医学博士许可使用）
在设计转基因时，研究人员创建了一个带有膜系链的转基因，以允许标记轴突过程，另一个带有核定位信号，第三个分布在细胞质中。这些老鼠可以让研究人员绘制大脑的电路图。然而，研究人员必须区分肉眼看起来像彩色抽象艺术的信号。因此，需要在通带中具有高透过率并且在其他地方很少或没有透过的发射滤光片。此外，滤光片可能需要具有相对窄的通带。这些参数的更好性能，以及探测器和显微镜的正确特性，使多色图像的映射更容易。
关于多色成像的其他组件，需要对物镜进行颜色校正。如果不是，则给定颜色集的信号和图像配准可能会受到不利影响。随着使用的颜色越来越多，对更均匀（至少是众所周知的）光谱响应的需求变得越来越重要。