荧光共振能量转移(FRET)的光学滤光片配置

荧光共振能量转移 (FRET) 测量的经典方法包括切换滤光片镜盒(参见图(a)、第22页中的滤光片和有关 FRET 的更多信息)。例 如,在受体光漂白方法中,首先使用供体特定的滤光片组镜盒(荧光激发块)来收集供体的发射光(如 CFP)。然后,用受体的滤 光片组镜盒(荧光激发块)对受体进行观察和光漂白(如 YFP)。在对受体光漂白前后对供体的强度进行测量,然后计算出 FRET 效率。滤光片的陡峭光谱边缘确保只有受体被光漂白,并将多重标记的 FRET 样品中因串色而产生的信号污染降至最低。这种技术缺 点如下:速度慢(更换滤光片组镜盒通常需要一秒钟或更长时间)和成像伪影(由于滤光片转盘的移动和其他振动)。

如图(b)所示,最常用的 FRET 成像方法通常称为 FRET 激发块镜盒方法。将一个特定于供体的单波段激发滤光片和一个单边缘二 向色镜放置在显微镜转盘的激发块镜盒中,用一个带有单波段发射滤光片的滤光片转轮来选择供体或受体的发射。与显微镜转盘相 比,滤光片转轮产生的振动更小,切换时间更快(低至数十毫秒),因此更适用于活细胞的 FRET 应用。

许多研究人员更喜欢使用 Sedat 滤光片组配置(滤光片见第33页)。这种方法在观察样品以及实验控制方面提供了额外的灵活性, 例如:找到仅用供体或受体标记的区域或样品,并从每个区域收集各自的纯光谱贡献。增加的灵活性也可用供者的光漂白方法来计 算 FRET 效率。

然而,最苛刻的FRET应用,如活细胞成像和单分子成像,可能 需要对供体和受体的发射信号进行“同时”成像。图(c)显示 了同时成像的配置,其中,放置在显微镜发射通道中的图像分离 二向色镜(见第64页)用于分离来自供体和受体的信号,并将其 引导至两个不同的 CCD 相机或同一个 CCD 相机的两个不同区 域。由于没有运动部件,该配置消除了基于运动的成像伪影。

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